親核芳香取代反應(yīng)（SNAr）是目前藥物化學(xué)和農(nóng)藥化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的反應(yīng)類型，通過SNAr反應(yīng)構(gòu)筑C-C和C-X化學(xué)鍵（X=O, N, S）的方式構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)有機(jī)分子。SNAr反應(yīng)通常需要較強(qiáng)的反應(yīng)環(huán)境，比如使用極性非質(zhì)子溶劑，化學(xué)計量比的堿性物質(zhì)，升高的反應(yīng)溫度，這導(dǎo)致難以控制反應(yīng)的選擇性。在SNAr反應(yīng)之外，人們還開發(fā)了幾種催化反應(yīng)，包括有機(jī)分子氫鍵或者相轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)。有鑒于此，曼徹斯特大學(xué)Igor Larrosa教授、Anthony P. Green教授等通過設(shè)計活化的Arg（精氨酸）殘基的酶進(jìn)行生物催化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了立體選擇性SNAr反應(yīng)。通過多輪定向進(jìn)化得到的工程化酶催化劑SNAr1.3比未工程化的酶催化劑性能提高了160倍，對缺電子芳烴實(shí)現(xiàn)了接近完美（>99 % e.e.）的立體選擇性控制。SNAr1.3的反應(yīng)速率達(dá)到0.15 s-1，TON達(dá)到>4000，對廣泛的親電試劑和親核試劑具有兼容，包括挑戰(zhàn)性的1,1-雙芳基立體結(jié)構(gòu)。通過生化、結(jié)構(gòu)、理論計算研究，揭示了SNAr1.3的催化反應(yīng)機(jī)理。反應(yīng)機(jī)理包括Arg124和Asp125關(guān)鍵殘基形成了一個鹵結(jié)合口袋。這項研究通過酶催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了具有里程碑意義的合成反應(yīng)，為SNAr催化反應(yīng)提供了高效率普適性的方法。圖1. SNAr（親核芳基取代反應(yīng)）和立體選擇性SNAr enzyme的定向進(jìn)化為了得到合適的酶起始模板，作者從前期研究發(fā)現(xiàn)具有可編程活性位點(diǎn)的Morita-Baylis-Hillman酶（MBH）開始。MBH酶具有Arg124殘基氫鍵供體能夠與相鄰的缺電子芳烴結(jié)合。由于人們在以往的研究中發(fā)現(xiàn)氫鍵催化劑能夠加快SNAr反應(yīng)速率，因此首先測試一系列MBH酶的混雜SNAr反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)BH32.8變體（記作SNAr1.0）能夠進(jìn)行乙基-2-氰基丙酸酯（1）和2,4-二硝基氯苯（2）的SNAr偶聯(lián)，BH32.8變體具有適中的轉(zhuǎn)化率和適中的立體選擇性（ca. 5 % e.e.）（圖1b）。隨后，對BH32.8（SNAr1.0）其進(jìn)行工程化設(shè)計，改善反應(yīng)活性和立體選擇性（圖1c）。首先對活性位點(diǎn)、以及二級配位球附近的41個殘基基團(tuán)使用NNK退化密碼子進(jìn)行隨機(jī)突變，隨后通過UPLC監(jiān)控1和2轉(zhuǎn)化為3的反應(yīng)情況。選擇其中最好的變體進(jìn)行下一輪的突變，將得到的有希望的突變體結(jié)合DNA改組（shuffling）方法結(jié)合。總共對4000個克隆體的測試，其中六個突變體作為SNAr1.3變體（圖1c和1e）。圖2. 鹵離去基團(tuán)對SNAr1.3活性的影響在His23殘基（MBH酶的關(guān)鍵親核位點(diǎn)）的進(jìn)化過程（排除His23殘基的親核催化SNAr），發(fā)現(xiàn)突變體能夠?qū)崿F(xiàn)93 %的轉(zhuǎn)化率，而且生成的唯一產(chǎn)物是3，比SNAr1.0僅為3 %的產(chǎn)率明顯更好，而且該突變體同樣得到更好的立體選擇性，立體選擇性達(dá)到96 % e.e.（遠(yuǎn)高于SNAr1.0的5 % e.e.）。通過X射線衍射表征得到產(chǎn)物3的絕對結(jié)構(gòu)。在制備量級的合成反應(yīng)中，以51 mg的2能夠達(dá)到90 %的轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物3分離收率達(dá)到70 %。重結(jié)晶的產(chǎn)物立體選擇性達(dá)到98 % e.e.。通過動力學(xué)實(shí)驗(yàn)測試催化反應(yīng)的詳細(xì)情況，結(jié)果表明反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)提高160倍，SNAr1.0和SNAr1.3的動力學(xué)常數(shù)分別為0.0040±0.0002 min-1和0.65±0.01 min-1，隨后在1的飽和濃度下測試反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果kcat/kM2增強(qiáng)160倍。此外，當(dāng)PBS緩沖液變成磷酸鈉，反應(yīng)速率能夠進(jìn)一步提高3倍，這是因?yàn)檩^高的Cl離子濃度阻礙酶催化性能。
調(diào)節(jié)鹵離去基團(tuán)對SNAr1.3催化活性和選擇性的影響。當(dāng)使用2的溴（4）和碘（5）類似物進(jìn)行反應(yīng)，酶催化活性分別提高3.8倍和8.6倍（圖2b）。當(dāng)使用碘的類似物（5），反應(yīng)速率達(dá)到8.81±0.11 mM-1 min-1，產(chǎn)物3的立體選擇性超過99 % e.e.，而且酶催化反應(yīng)的TON達(dá)到4000（圖2c）。通過制備量的反應(yīng)（當(dāng)SNAr1.3的量僅為0.5 mol %，能夠以>99 %的轉(zhuǎn)化率和91 %的分離收率和99 % e.e.立體選擇性生成150 mg (R)-3），驗(yàn)證了酶催化反應(yīng)的應(yīng)用前景。反應(yīng)兼容性。通過對各種親電、親核偶聯(lián)反應(yīng)物的兼容性測試，研究了SNAr1.3的兼容性（圖3a）。非常重要的是，SNAr1.3對許多硝基芳烴兼容，包括氰基、三氟甲基、酯、酮、磺基、吡啶環(huán)的底物兼容，能夠得到較好或者優(yōu)異的e.e.立體選擇性（圖3a），而且在這些反應(yīng)中沒有發(fā)現(xiàn)副反應(yīng)產(chǎn)物生成。此外，反應(yīng)對親電試劑具有非常好的兼容性，比如酯、酰胺、2-烷基取代基，對含有C-芳基的環(huán)狀β-酮酯同樣兼容。這個結(jié)果與化學(xué)催化反應(yīng)（使用化學(xué)計量比的堿或者小分子有機(jī)催化劑）生成O-芳基化和C-芳基化混合物的現(xiàn)象明顯區(qū)別。此外，SNAr1.3能夠使用乙基2-硝基丙酸酯合成含有四級N立體中心的光學(xué)純化合物。另外SNAr1.3能夠使用苯酚或者活化的有機(jī)醇作為親核試劑（pKa<12.4）構(gòu)筑C-O化學(xué)鍵，形成雙芳基醚或者芳基烷基醚。構(gòu)筑1,1-雙芳基的四級碳結(jié)構(gòu)化合物。該反應(yīng)能夠構(gòu)筑生物活性化合物中常見的雙芳基四級碳結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的立體選擇性構(gòu)筑是個非常大的挑戰(zhàn)。作者測試了2和乙基2-氰基-2苯乙酸的反應(yīng)，使用SNAr1.2實(shí)現(xiàn)了適中的轉(zhuǎn)化率（27 %）和適中的立體選擇性（46 % e.e.）。隨后通過定向進(jìn)化得到變體SNArPh1.0，催化活性提高3倍，并且立體選擇性達(dá)到84 % e.e.。當(dāng)使用芳基碘化物作為反應(yīng)物替代芳基氯，轉(zhuǎn)化率能夠提高至96 %，立體選擇性達(dá)到87 % e.e.。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SNArPh1.0能夠作為具有應(yīng)用價值的催化劑合成各種1,1-雙芳基化產(chǎn)物。SNAr1.3的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理圖4. SNAr1.3的結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究作者通過生化實(shí)驗(yàn)、結(jié)構(gòu)表征、理論計算等研究手段研究SNAr1.3的催化反應(yīng)機(jī)理，以及酶進(jìn)化是如何增強(qiáng)催化反應(yīng)的活性。首先，驗(yàn)證了SNAr是否與4-氯苯甲酰-CoA脫鹵酶（4-chlorobenzoyl-CoA dehalogenase）類似，通過形成酶-反應(yīng)物的共價結(jié)構(gòu)中間體，作者將SNAr1.3和芳基鹵化物5分子在沒有加入親核偶聯(lián)試劑的情況下，放在一起培養(yǎng)。隨后檢測鹵的產(chǎn)生以及蛋白的質(zhì)量變化情況。觀測發(fā)現(xiàn)沒有因?yàn)榉蓟u化物水解產(chǎn)生的酚類產(chǎn)物。結(jié)果表明在催化反應(yīng)（8.8 min-1）的區(qū)間內(nèi)，沒有產(chǎn)生酶和反應(yīng)物形成的共價結(jié)構(gòu)中間體，說明SNAr1.3催化反應(yīng)過程沒有生成芳基-酶的中間體。通過X射線晶體表征（1.8 ?）研究SNAr1.3的反應(yīng)機(jī)理。通過K39A變體在蛋白表面進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析，結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明SNAr1.3與SNAr1.0沒有明顯區(qū)別（RMSD 0.89 ?）。隨后的表征發(fā)現(xiàn)兩個內(nèi)部碘結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)由Met64、Arg65、Arg124、Asp125、Pro128構(gòu)成（圖4a）。Arg和Asp是天然鹵結(jié)合口袋常見的殘基位點(diǎn)。將SNAr1.3和5一起進(jìn)行結(jié)晶，得到的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)兩個不同的結(jié)構(gòu)，表明反應(yīng)物結(jié)合具有異質(zhì)性。5結(jié)合的位置主要位于鹵結(jié)合空位（圖4b），同時在芳基反應(yīng)物的下部具有另一個空位，能夠用于容納親核性的偶聯(lián)反應(yīng)物分子。對鹵結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)選擇性突變研究。R124A和D125N/A突變能夠?qū)⒎磻?yīng)速率降低180倍或者68/22倍，M64A和R65A變體導(dǎo)致反應(yīng)速率降低5.4倍或10倍。這些研究結(jié)果進(jìn)一步的說明，鹵結(jié)合口袋對于催化反應(yīng)的重要作用。總之，這項研究為SNAr催化反應(yīng)建立了酶催化反應(yīng)的解決方案，SNAr反應(yīng)是化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域最重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型。這項研究關(guān)注于開發(fā)能夠構(gòu)筑四級碳立體位點(diǎn)的酶催化劑。這項研究表明，這種SNAr酶能夠用于合成含氮的立體中心位點(diǎn)，構(gòu)筑C-O化學(xué)鍵，進(jìn)行區(qū)域選擇性的SNAr反應(yīng)，表明著這種工程化的酶催化劑具有廣闊的合成應(yīng)用前景。這項研究開發(fā)的SNAr酶具有令人印象深刻的催化活性、選擇性、反應(yīng)物兼容性。這項研究僅僅包括4000個變體，深入的研究蛋白的序列能夠的高更多具有前景的SNAr酶催化劑，包括對更加惰性的親電、親核試劑兼容。結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究為開發(fā)SNAr1.3用于高效選擇性催化的活性位點(diǎn)提供幫助。這項研究的分析結(jié)果為從頭設(shè)計特定功能需求的SNAr酶催化劑的設(shè)計提供幫助。通過將現(xiàn)代蛋白設(shè)計方法和高通量的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)結(jié)合，這項研究有助于推動開發(fā)更多更具價值的SNAr變體，促進(jìn)現(xiàn)有合成方法學(xué)的發(fā)展。
參考文獻(xiàn)
Lister, T.M., Roberts, G.W., Hossack, E.J.et al. Engineered enzymes for enantioselective nucleophilic aromatic substitutions. Nature (2025).
DOI: 10.1038/s41586-025-08611-0
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08611-0
