細(xì)胞膜工程化設(shè)計(jì)用于催化具有非常大的困難與挑戰(zhàn)，這是因?yàn)榧?xì)胞膜非常復(fù)雜。有鑒于此，南丹麥大學(xué)吳昌柱教授等報(bào)道在細(xì)胞膜上修飾催化聚合物（catalytic polymer）的聚合策略，克服細(xì)胞膜工程化的困難和挑戰(zhàn)，得到穩(wěn)健、可循環(huán)利用的光酶催化劑。通過(guò)在大腸桿菌（Escherichia coli）活體細(xì)胞的一步原位原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，在細(xì)胞形成具有保護(hù)能力的聚合物層，能夠保護(hù)細(xì)胞免于受到環(huán)境壓力，同時(shí)能夠通過(guò)催化聚合物與細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行協(xié)同的化學(xué)酶催化合成。通過(guò)蒽醌聚合物、苯甲醛裂合酶（benzaldehyde lyase）構(gòu)成串聯(lián)的光酶催化體系，能夠?qū)⒈郊状嫁D(zhuǎn)化為苯偶姻，比對(duì)照組的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率提高15倍。此外，細(xì)胞能夠作為聚合物的生物骨架，用于大分子催化劑的回收。這種催化體系能夠安裝有機(jī)金屬聚合物實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)的酶，構(gòu)成可重復(fù)利用的化學(xué)酶催化體系。這種多功能的直接方法提供了細(xì)胞膜工程化的平臺(tái)，構(gòu)筑串聯(lián)合成過(guò)程，對(duì)合成化學(xué)、聚合物化學(xué)、生物技術(shù)等方面具有廣泛的影響。圖1. 聚合物修飾細(xì)胞的制備過(guò)程，以及聚合物修飾細(xì)胞在化學(xué)酶串聯(lián)催化中的應(yīng)用通過(guò)兩步將聚合物修飾在大腸桿菌細(xì)胞表面。首先，將引發(fā)劑共軛連接在細(xì)胞表面，在引發(fā)劑的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的酯官能團(tuán)和細(xì)胞表面豐富的一級(jí)胺之間形成酰胺化學(xué)鍵。通過(guò)修飾熒光染料（Fluor 647）的NHS酯引發(fā)劑，驗(yàn)證了引發(fā)劑能夠與細(xì)胞表面形成酰胺化學(xué)鍵。測(cè)試發(fā)現(xiàn)，修飾熒光染料的情況下，細(xì)胞表面展示持續(xù)時(shí)間達(dá)到30 min的紅色熒光。通過(guò)這個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，隨后在KPI緩沖溶液中，將M1單體分子和ATRP催化劑與修飾引發(fā)劑的細(xì)胞進(jìn)行聚合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了M1分子修飾在細(xì)胞表面。通過(guò)UV-Vis光譜表征驗(yàn)證形成P1聚合物（在328nm處具有M1單體的UV-Vis吸收峰）。通過(guò)加入不同量單體分子，能夠控制聚合物的擔(dān)載量。通過(guò)這種方法，在大腸桿菌表面修飾了數(shù)量不同的聚合物催化劑，分別為低含量（L）、中度（M）、大量（H）。吸收峰的強(qiáng)度與聚合物的擔(dān)載量有關(guān)，說(shuō)明聚合反應(yīng)的可調(diào)性。而且，當(dāng)體系只有細(xì)胞和單體的情況，沒(méi)有在UV-Vis光吸收曲線(xiàn)中觀測(cè)發(fā)現(xiàn)形成聚合物。圖2. 修飾聚合物的表征以及聚合物在細(xì)胞表面的分布通過(guò)TGA熱重分析驗(yàn)證修飾聚合物產(chǎn)生熱重量的變化更大，FTIR紅外光譜表征聚合物的特征峰。聚合物修飾能夠影響細(xì)胞表面的性質(zhì)。修飾聚合物導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生疏水性，接觸角從19°增加至78°（H聚合樣品），說(shuō)明表面修飾大量的疏水性大分子。測(cè)試ζ電勢(shì)發(fā)現(xiàn)，從大腸桿菌的本征值（-42mV）變?yōu)?/span>-5mV，而且當(dāng)修飾的是正電荷單體，ζ電勢(shì)能夠達(dá)到+10mV。總之，這些表征結(jié)果表明，聚合反應(yīng)能夠有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的性質(zhì)，也說(shuō)明聚合物修飾在細(xì)胞表面。將Eosin Y染料分子修飾丙烯酸酯官能團(tuán)得到3號(hào)單體（M3），將M3/M1以1:10的比例共聚修飾在細(xì)胞表面，隨后進(jìn)行落射熒光顯微鏡（epifluorescence microscopy）表征，驗(yàn)證共聚修飾后，細(xì)胞產(chǎn)生黃色熒光。這個(gè)現(xiàn)象與沒(méi)有聚合物修飾的細(xì)胞明顯不同。通過(guò)SIM和STED顯微成像進(jìn)一步測(cè)試聚合物的分布情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜具有明顯的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明聚合反應(yīng)只在細(xì)胞表面進(jìn)行。而且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)聚合物均勻的分布在細(xì)胞膜表面，驗(yàn)證了聚合物確實(shí)結(jié)合在細(xì)胞膜的表面。此外，作者通過(guò)修飾S-S化學(xué)鍵，合成了一種可切斷的引發(fā)劑，這種引發(fā)劑對(duì)于TCEP（三(2-羧乙基)膦）不穩(wěn)定。這種引發(fā)劑修飾在細(xì)胞表面，并且隨后通過(guò)加入TCEP將引發(fā)劑切斷，最后通過(guò)透析進(jìn)行提純。凝膠滲透色譜法GPC（gel permeation chromatography）分析結(jié)果表明，修飾的P1聚合物的分子量為11563g mol-1，計(jì)算表明P1含有25個(gè)M1單體。這個(gè)結(jié)果與對(duì)照組PNIPAM（分子量3390g mol-1）中含有27個(gè)NIPAM的情況非常類(lèi)似。
修飾聚合物的細(xì)胞的生存力和增殖
通過(guò)將聚合物修飾在細(xì)胞表面，通過(guò)Cu(I)催化劑研究ATRP聚合對(duì)細(xì)胞生存力的影響。通過(guò)兩種熒光染料化合物SYTO 9（綠色）、碘化丙啶（紅色）對(duì)活體和死亡的細(xì)胞進(jìn)行選擇性染色，因此能夠進(jìn)行活體/死亡測(cè)試。分別對(duì)沒(méi)有修飾的大腸桿菌、修飾引發(fā)劑的大腸桿菌、修飾聚合物的大腸桿菌比較。結(jié)果表明，沒(méi)有修飾的細(xì)胞都呈現(xiàn)綠色熒光，表明存活率達(dá)到100%。修飾引發(fā)劑、聚合物的細(xì)胞沒(méi)有明顯區(qū)別，存活率分別為98%和96%。這個(gè)表征結(jié)果驗(yàn)證了聚合物修飾具有生物相容性，驗(yàn)證了使用低濃度Cu(I)催化劑就能夠通過(guò)ATRP反應(yīng)對(duì)活體細(xì)胞修飾聚合物。隨后，作者通過(guò)電子顯微鏡（SEM和cryo-TEM）對(duì)聚合物修飾的細(xì)胞進(jìn)行表征。并且，對(duì)于液體培養(yǎng)或者固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖能力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明ATRP或者聚合物修飾不影響細(xì)胞增殖。而且，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂導(dǎo)致細(xì)胞表面聚合物層逐漸消失，因此需要使用新制備的聚合物修飾大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究和測(cè)試。圖3. 聚合物修飾大腸桿菌細(xì)胞的存活率和增殖
光催化、生物催化兼容性
對(duì)于合成催化劑和生物催化劑的集成體系而言，主要關(guān)心的是集成后有可能導(dǎo)致催化劑失活。作者將蒽醌聚合物（P1）修飾在大腸桿菌表面，能夠?qū)⑤祯墓獯呋阅芎蜕锵嗳菪跃?。?shí)驗(yàn)表征結(jié)果表明，P1修飾的大腸桿菌能夠?qū)⒈郊状嫁D(zhuǎn)化為苯甲醛，說(shuō)明細(xì)胞微環(huán)境對(duì)聚合物催化劑基本上沒(méi)有影響。圖4. 光催化、生物催化在聚合物修飾大腸桿菌的兼容性當(dāng)增加聚合物的量，從L-聚合物提高至H-聚合物，轉(zhuǎn)化率有一定的增加。從整體的性能和催化劑用量平衡的角度，選擇M-聚合物進(jìn)一步進(jìn)行催化研究。在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)三個(gè)不同的酶，隨后都按照相同步驟修飾P1聚合物，并研究催化性能。首先測(cè)試了苯甲醛裂合酶（BAL, benzaldehyde lyase）在苯偶姻縮合反應(yīng)的催化活性，結(jié)果表明聚合物修飾后，酶催化活性與本征的酶催化活性基本上沒(méi)有區(qū)別，說(shuō)明光催化劑沒(méi)有影響生物催化劑的性能，說(shuō)明聚合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酶催化活性沒(méi)有影響。而且通過(guò)熒光表征實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了聚合物和細(xì)胞在物理性質(zhì)和生理上都保持穩(wěn)定和活性。此外，將南極假絲酵母脂肪酶CalB（Candida antarctica lipase B）在大腸桿菌內(nèi)過(guò)度表達(dá)，并且在大腸桿菌修飾P1聚合物。測(cè)試結(jié)果表明，修飾的聚合物光催化劑沒(méi)有受到影響。將輔酶依賴(lài)性的醇脫氫酶ADH-a（Rhodococcus ruber，赤紅球菌）在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。結(jié)果表明聚合物修飾后對(duì)ADH-a的酶催化活性基本上沒(méi)有影響。而且，該反應(yīng)能夠在沒(méi)有補(bǔ)充NADH的情況進(jìn)行反應(yīng)，表明細(xì)胞內(nèi)在代謝完整。這些結(jié)果表明，細(xì)胞膜修飾的光催化劑和細(xì)胞內(nèi)的酶催化劑之間沒(méi)有相互不利的影響，而且反應(yīng)物能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，說(shuō)明這個(gè)體系能夠作為一種能夠適應(yīng)各種生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用的普適性策略。
抵御外部壓力
圖5. 聚合物保護(hù)細(xì)胞抵抗外部應(yīng)力環(huán)境作者研究了聚合物如何有助細(xì)胞在各種工業(yè)常見(jiàn)的外部壓力環(huán)境下改善細(xì)胞，分別比較了修飾聚合物的細(xì)胞和沒(méi)有修飾聚合物的細(xì)胞。首先，測(cè)試含有有害溶劑的甲苯-水溶劑界面張力的環(huán)境，測(cè)試結(jié)果表明修飾聚合物后的細(xì)胞存活率達(dá)到83%。相比，沒(méi)有修飾聚合物的細(xì)胞在相同環(huán)境下存活量基本消失。此外，當(dāng)細(xì)胞暴露在強(qiáng)酸性、紫外線(xiàn)輻照、高溫等條件，修飾聚合物的細(xì)胞都具有類(lèi)似的改善存活效果。此外，修飾聚合物能夠改善極端環(huán)境下大腸桿菌內(nèi)的酶催化劑穩(wěn)定性。在甲苯-水界面處測(cè)試CalB酶的穩(wěn)定性，結(jié)果表明修飾聚合物后，CalB酶的活性保持超70%，沒(méi)有修飾聚合物的CalB酶的活性降低至35%。異丙醇、DMF、DMSO等溶劑同樣展示了聚合物具有非常好的保護(hù)性。此外，在強(qiáng)酸性、UV光輻照、甚至是提高溫度，修飾聚合物的細(xì)胞內(nèi)CalB的穩(wěn)定性都顯著改善。通過(guò)一鍋酶串聯(lián)反應(yīng)，驗(yàn)證極端環(huán)境下的兩種酶穩(wěn)定性。將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來(lái)源醇脫氫酶（ADH-ht）和苯甲醛裂合酶（BAL）兩種構(gòu)成串聯(lián)酶催化體系，隨后苯甲醇通過(guò)ADH-ht轉(zhuǎn)化為苯甲醛，苯甲醛通過(guò)BAL轉(zhuǎn)化為苯偶姻。在暴露在甲苯-水界面1h后，表面修飾聚合物的細(xì)胞活性保留60%，表明聚合物保護(hù)的細(xì)胞具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，對(duì)比沒(méi)有修飾聚合物的細(xì)胞活性降低至30%。分別在高酸度、UV光輻照、提高溫度的條件測(cè)試酶的穩(wěn)定性，結(jié)果都表明表面修飾聚合物后，細(xì)胞的穩(wěn)定性得到改善。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明聚合物修飾能夠保證細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)的酶催化劑穩(wěn)定性。圖6. 聚合物修飾的大腸桿菌進(jìn)行光酶串聯(lián)催化將化學(xué)催化劑和生物催化劑集成，構(gòu)筑串聯(lián)催化劑體系具有非常大的困難，因?yàn)榛瘜W(xué)催化劑和生物催化劑不同，并且反應(yīng)條件不同。作者將光催化劑（P1）與細(xì)胞內(nèi)的酶催化劑集成用于光酶催化反應(yīng)。將BAL在大腸桿菌內(nèi)過(guò)量表達(dá)，隨后將光催化劑（P1）修飾在細(xì)胞膜表面，并且分別修飾不同量（H-聚合物，M-聚合物，L-聚合物）。將這種光酶復(fù)合體系用于光酶催化合成不對(duì)稱(chēng)R-苯偶姻。在UV光輻照作用下，成功的實(shí)現(xiàn)了光酶催化反應(yīng)，其中M-聚合物得到最高的產(chǎn)量。與沒(méi)有修飾聚合物的本征酶催化劑進(jìn)行對(duì)比，M-聚合物修飾的細(xì)胞生成18 mM苯偶姻，比單體修飾的細(xì)胞高9倍，比聚合物+細(xì)胞混合物高15倍。另外，這種光酶串聯(lián)催化劑體系可以方便的回收。通?；瘜W(xué)酶催化劑體系由于體系復(fù)雜，含有兩種性質(zhì)不同的催化劑，因此非常難以回收。這個(gè)光酶復(fù)合催化體系的催化劑回收非常方便，因?yàn)榧?xì)胞的尺寸達(dá)到微米量級(jí)，因此通過(guò)離心和過(guò)濾等傳統(tǒng)技術(shù)就能夠回收。而且，在6次循環(huán)催化反應(yīng)測(cè)試中，催化活性未見(jiàn)明顯降低。此外，通過(guò)存活率測(cè)試回收的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)仍然具有綠色熒光，說(shuō)明在多次催化反應(yīng)循環(huán)過(guò)程中，細(xì)胞得以存活。此外，作者研究其他光酶串聯(lián)催化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)體系具有普適性。將表達(dá)CalB的大腸桿菌生成苯甲醇，隨后通過(guò)光催化反應(yīng)生成苯甲醛，能夠生成40mM的苯甲醛。這個(gè)結(jié)果明顯比沒(méi)有修飾聚合物的體系（2mM）或者修飾單體分子的體系（3mM）更高。此外，在這個(gè)兩步串聯(lián)體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)筑了三步光酶催化串聯(lián)催化體系，催化反應(yīng)結(jié)果表明這種三步串聯(lián)光酶催化體系能夠生成10mM產(chǎn)物，對(duì)照的沒(méi)有修飾聚合物的細(xì)胞或者修飾單體的細(xì)胞生成的量少于2mM。這些研究結(jié)果表明結(jié)合在細(xì)胞膜上的聚合物能夠作為穩(wěn)健、可回收、多步驟的光酶催化劑。圖7. 聚合物修飾的大腸桿菌細(xì)胞的化學(xué)-酶串聯(lián)催化基于聚合物修飾細(xì)胞體系的成功，作者將Ru和手性配體構(gòu)成的金屬有機(jī)化合物單體（M2）修飾在大腸桿菌上，在大腸桿菌中表達(dá)胺轉(zhuǎn)氨酶（ATA）。設(shè)計(jì)將聚合物P2修飾在細(xì)胞外，細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)疏水性，接觸角為56°。通過(guò)SEM、TEM、SIM等表征技術(shù)驗(yàn)證聚合物修飾到細(xì)胞膜上。通過(guò)UV-Vis檢測(cè)細(xì)胞膜上的Ru穩(wěn)定性，結(jié)果表明在24 h長(zhǎng)時(shí)間孵化過(guò)程中，Ru基本上沒(méi)有去掉。通過(guò)cryo-TEM表征驗(yàn)證修飾聚合物前后結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)保持，金屬有機(jī)聚合物修飾不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的存活率降低，不影響細(xì)胞的增殖，不影響細(xì)胞內(nèi)的酶催化活性。金屬有機(jī)聚合物修飾細(xì)胞的串聯(lián)催化。測(cè)試了α-甲基芐胺被轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為苯乙酮，隨后被有機(jī)聚合物催化劑轉(zhuǎn)化為手性醇。結(jié)果表明，細(xì)胞表面修飾聚合物后，能夠生成25mM的產(chǎn)物，明顯比對(duì)照組更高（<1mM）。此外，這種復(fù)合催化劑在6次重復(fù)性催化反應(yīng)過(guò)程中，催化活性沒(méi)有明顯的降低。
總結(jié)
這項(xiàng)研究設(shè)計(jì)了將生物大分子修飾在大腸桿菌的細(xì)胞膜表面策略的概念驗(yàn)證，為開(kāi)發(fā)非天然的新型應(yīng)用提供幫助。這項(xiàng)工作通過(guò)生物兼容的ATRP過(guò)程，將聚合物修飾到細(xì)胞表面，能夠?qū)Χ喾N多樣的環(huán)境應(yīng)力下的細(xì)胞提供保護(hù)。從更廣泛的角度，這項(xiàng)研究展示了細(xì)胞的化學(xué)工程化設(shè)計(jì)策略，為應(yīng)用其他類(lèi)型的細(xì)胞和聚合物解決生物醫(yī)藥和生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的挑戰(zhàn)提供機(jī)會(huì)。這項(xiàng)方法具有簡(jiǎn)單和保護(hù)性的功能，因此聚合物修飾的細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)酶串聯(lián)催化反應(yīng)。作者將三個(gè)酶在酶中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，分別與兩種聚合物催化劑結(jié)合。此外，這種細(xì)胞能夠作為聚合物催化劑的生物載體，促進(jìn)催化劑的循環(huán)利用。通過(guò)這些成功的結(jié)果，作者認(rèn)為這種聚合工程策略能夠進(jìn)一步開(kāi)發(fā)普適性化學(xué)酶催化劑，促進(jìn)可持續(xù)化學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步。
參考文獻(xiàn)
Ning, J., Sun, Z., Hübner, R.et al. Engineering living cells with polymers for recyclable photoenzymatic catalysis. Nat Catal (2024).
DOI: 10.1038/s41929-024-01259-5
https://www.nature.com/articles/s41929-024-01259-5
