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原創丨米測MeLab
編輯丨風云
研究背景
α,β-不飽和羰基化合物是一類在有機合成中具有巨大實用性和多功能性的特殊分子。為此，在預先建立的分子框架內直接脫氫以在羰基官能團相鄰處引入 C=C鍵是獲取這些分子最理想的策略之一。在過去的幾十年里，已經建立了大量實現羰基去飽和的方法，包括1978年報道的著名的Saegusa-Ito氧化以及各種較新的方法。
關鍵問題
然而，羰基去飽和的應用主要存在以下問題：
1、現有的羰基去飽和化方法反應條件較為嚴苛
目前，大多數現有羰基去飽和化方法需要使用高負載的金屬或強氧化劑，或者涉及多步反應序列，這限制了這些方法的實用性和環境友好性。
2、能夠精確控制去飽和過程的立體化學方法十分罕見
能夠精確控制去飽和過程的立體化學的方法非常罕見，這限制了對這種轉化的全部合成潛力的探索，尤其是在實現高效合成有價值的手性α,β-不飽和羰基化合物方面。
新思路
有鑒于此，西湖大學葉宇軒等人在此報告了一種生物催化平臺，用于對環己酮進行去對稱化去飽和，以生成具有遠程四級立體中心的多種環己酮，通過重新設計“烯”還原酶來有效介導脫氫，即其天然活性的逆過程。這種基于“烯”還原酶的去飽和系統在溫和條件下以空氣作為終端氧化劑運行，可耐受氧化敏感或金屬不相容的功能團，更重要的是，與使用小分子催化劑相比，它表現出無與倫比的立體選擇性。機理研究表明，該反應通過 α-去質子化，隨后進行速率決定的 β-氫化物轉移進行。
技術方案：
1、闡述了生物催化反應的發現和優化過程
作者構建了ERED庫，篩選出CrS和GkOYE在去飽和反應中表現最佳。通過定向進化，CrS和GkOYE的突變體顯著提高了催化效率和對映選擇性。
2、證明了酶去飽和方案的合成潛力和實用性
作者開發的酶庫展示了廣泛的底物耐受性，成功催化多種4-烷基-4-芳基環己酮去飽和，包括含氧化敏感基團和雜環的底物，產率高，對映選擇性好。克級規模反應和產物轉化證明了該方法的合成潛力。
3、提出了生物催化去飽和反應的機制
研究揭示了生物催化去飽和反應的機制，包括α-去質子化和β-氫化物轉移，并通過實驗驗證了關鍵步驟。
技術優勢：
1、開發了生物催化平臺實現了對映選擇性脫氫
作者通過利用黃素依賴性“烯”還原酶（ERED）的固有遺傳多樣性，并結合定向進化技術，成功解決了羰基去飽和化過程中的挑戰，實現了對映選擇性脫氫。
2、開發基于ERED的去飽和系統，實現了無與倫比的立體選擇性
作者開發了一種基于“烯”還原酶的去飽和系統，該系統能夠在溫和條件下以空氣作為終端氧化劑運行，并且展現出對氧化敏感或金屬不相容的功能團的耐受性，以及無與倫比的立體選擇性，這在以往的小分子催化劑中是難以實現的。
技術細節
反應發現和優化
作者構建了一個結構多樣的ERED庫，評估了它們在有氧條件下對4-甲基-4-苯基環己酮進行對映選擇性去飽和的催化效率。大多數酶活性較低，但OYE1、OYE2、CrS和GkOYE表現出中等活性和良好的對映選擇性。反應優化顯示，一些ERED的脫氫活性隨溫度升高而提高，如TOYE在50°C下的產率是室溫下的八倍。熱穩定性ERED在接近其熔化溫度Tm下測試，CrS和GkOYE表現出最佳性能，產率分別達到30%和49%，對映體比均為98:2。通過定向進化，對CrS和GkOYE進行了多輪位點飽和誘變，提高了它們的催化性能。CrS的Y27突變為較小氨基酸殘基顯著提高脫氫活性，而GkOYE的三重突變體GkOYE3以96%的產率和>99:1的對映體比催化生成2。
圖 羰基脫飽和反應
圖 CrS和GkOYE酶去對稱脫氫反應的發現和定向進化
范圍和限制
該研究通過構建一個包含有益突變體的重點酶庫，探索了酶系統對各種4-烷基-4-芳基環己酮底物的耐受性。結果顯示，環己酮苯環上的多種取代基如氯、甲氧基、三氟甲基、二甲氨基和甲硫基均被良好耐受。特別地，含2-氨基苯基的環己酮底物通過去飽和形成的烯酮中間體自發分子內環化，以99%產率生成酮吲哚，具有出色的非對映選擇性。該生物催化去飽和方案對氧化敏感功能基團如胺和硫醚表現出高耐受性，電子缺乏和豐富的雜環也是相容的。此外，多種烷基和含酯環己酮也順利參與反應，展現了良好的產率和對映選擇性。在克級規模上，模型反應也取得了高產率和高對映選擇性的結果，進一步證明了該酶去飽和方案的合成潛力和實用性。
圖 4-烷基-4-芳基環己酮去對稱脫氫的范圍
圖 其他類別環己酮的去對稱脫氫范圍
圖 制備規模合成和產品衍生化
機理分析
本研究提出了生物催化去飽和反應的機制。底物1在保守酪氨酸陰離子Y169作用下α-去質子化，形成烯醇鹽Int1，然后通過路徑A轉移β-氫化物至FMNox，生成去飽和產物2和FMNhq，或通過路徑B進行單電子轉移形成α-酰基自由基中間體Int2和FMNsq。氘摻入實驗顯示Y169促進兩個α質子的去質子化，而Y169A突變體顯著降低去飽和活性。自由基鐘實驗表明反應符合β-氫化物轉移機制。動力學研究揭示α位和β位的KIE值與提出的反應途徑一致。GkOYE3在去飽和半反應中比GkOYE-WT快約57倍，在反向還原中慢約0.7倍，與氧氣反應中快約1.5倍，表明定向進化產生的突變體在關鍵步驟中去飽和效果更好。
圖 機理分析
展望
總之，作者利用此類酶的遺傳多樣性和定向進化的力量，成功地將ERED重新用于高效和對映選擇性脫氫。該生物催化脫飽和平臺代表了一項具有廣泛合成用途的寶貴進步，能夠在溫和條件下使用空氣作為終端氧化劑獲得具有遠程四級手性中心的多種環己酮。這種去對稱化脫氫反應為未來開發生物催化脫飽和系統奠定了基礎，其反應性和選擇性是小分子催化劑無法比擬的。
參考文獻：
Wang, H., Gao, B., Cheng, H. et al. Unmasking the reverse catalytic activity of ‘ene’-reductases for asymmetric carbonyl desaturation. Nat. Chem. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41557-024-01671-1
