一氧化氮（NO）是一種在人體內發揮重要作用的信號分子，其功能廣泛且深遠，參與了多種關鍵的生理過程。在心血管系統中，NO 通過擴張血管和調節血流量，確保組織和器官的充分供氧；在細胞層面，NO 可以維持細胞的活力與正常功能，保護心肌細胞和神經細胞免受損傷。此外，NO 還具有抗炎和抗氧化特性，對維持機體穩態具有重要意義。然而，NO 信號傳遞的異常與多種重大疾病的發病機制息息相關。例如，在心腦血管疾病中，NO 水平的不足會導致血管收縮、血流受阻，甚至誘發血栓形成；在神經退行性疾病中，NO 的過量生成可能損傷神經元，加速疾病進展。此外，NO 異常也被發現與慢性肝炎、糖尿病及多種癌癥的發生密切相關。研究表明，NO 對人體的生理和病理影響高度依賴其濃度。在癌癥中，NO 的作用尤為復雜：低濃度的 NO 可以通過促進腫瘤血管生成和細胞轉移，加速腫瘤的發展；而高濃度的 NO 則表現出細胞毒性作用，能夠抑制腫瘤細胞的生長甚至誘導其凋亡。同樣，在肝臟疾病中，NO的雙重作用也非常顯著：低濃度的 NO 有助于維持肝臟穩態，抑制炎癥反應，防止纖維化的發生；但一旦 NO 的生成超過生理范圍，就可能引發肝細胞凋亡，促進炎癥反應，并最終增加肝癌的風險。因此，準確測定生物組織中 NO 的濃度，對深入理解其在不同病理生理狀態下的多重作用具有重要意義。這不僅有助于揭示疾病的發病機制，還為疾病的診斷和治療提供了潛在的靶點和依據。隨著研究的不斷深入，NO 在醫學領域的應用前景也將更加廣闊。在生物體內精確地定量一氧化氮（NO）的水平仍然是一項極具挑戰性的任務。這主要是由于 NO 本身的化學性質決定的：其半衰期短、濃度低且在體內環境中易受多種因素影響。目前，傳統的檢測方法，如基于化學試劑盒的測量手段，難以在復雜的生物體系中提供準確可靠的數據，限制了其在活體研究中的應用。安培法作為一種較為先進的電化學檢測技術，因其具有較高的靈敏度和實時監測的能力，成為 NO 定量研究中的重要工具。然而，該方法需要直接插入電極進行檢測，具有一定的侵入性。同時，其信號獲取范圍局限于電極周圍的小區域，難以實現對組織或器官的全面評估，限制了其實用價值。近年來，非侵入性成像技術如熒光成像、光聲成像和余輝成像，為 NO 的檢測提供了新的可能。這些技術能夠以較小的干預實現體內信號的捕獲，且具有較好的時間和空間分辨率。然而，由于光學信號在生物組織中的穿透深度有限，這些方法主要適用于淺表組織的研究，難以滿足全身成像和深層組織檢測的需求。此外，電子順磁共振（EPR）成像作為一種專門用于自由基檢測的技術，因其能夠提供深層組織的成像能力而備受關注。這種方法在成像深度上具有顯著優勢，能夠突破光學成像技術的限制。然而，EPR 成像的一個主要不足在于其靈敏度較低，難以實現對 NO 濃度變化的動態監測。這一缺陷使其在需要高時間分辨率的應用場景中表現受限。總的來說，目前對體內 NO 的檢測手段各有優劣，尚未有一種方法能夠在靈敏度、穿透深度和動態監測能力之間取得完美平衡。因此，開發新型的、多功能的 NO 檢測技術，或者結合現有技術進行優化，將是未來研究的關鍵方向。這不僅能夠推動對NO 生理和病理作用的深入理解，也將為相關疾病的診斷和治療提供更加精準的工具和策略。磁共振成像（MRI）是一種強大且廣泛應用于醫學領域的成像技術，以其高空間分辨率、深部組織穿透能力和非電離輻射的優勢，被廣泛用于各種臨床疾病的診斷和監測。由于 MRI 具備出色的成像特性，它被認為在全身范圍內評估一氧化氮（NO）水平方面具有巨大的潛力，尤其是在需要深入了解 NO 的動態變化和空間分布的研究中。目前，用于 NO 檢測的 MRI 探針主要基于順磁性金屬離子開發，如鐵、錳和釓等，這些金屬離子具有顯著的磁性，可通過與周圍環境的相互作用影響 MRI 的信號強度。這類探針的基本工作原理是通過調節順磁中心（例如金屬離子）與水分子的結合數目或化學環境，響應 NO 的存在從而產生信號變化。然而，這類探針在實際應用中存在顯著的局限性：其初始MRI 信號較弱，且在 NO 存在下信號的變化范圍有限，這使得它們難以對體內微小的 NO 濃度波動進行敏感檢測。這種不足嚴重制約了探針在生物醫學研究中的應用價值，特別是在需要高靈敏度的場景中，例如動態監測 NO 的生成、擴散和代謝過程，或者評估疾病進展中 NO 的作用。因此，用于成像體內NO的 MRI 探針仍需進一步優化，例如提升初始信號強度、擴大信號響應范圍，以及改進其對 NO 的特異性識別能力。近日，湖南大學化學生物傳感國重室的宋國勝教授與張曉兵教授率領團隊報道了一種基于超順磁性納米顆粒的NO成像探針，通過NO切割反應調控納米探針的飽和磁化率，從而實現NO體內高靈敏度的檢測。該探針能夠檢測濃度低至 0.147 μM 的 NO，從而能夠在小鼠腫瘤模型中對NO 進行準確成像和定量，并研究其對腫瘤進展和免疫的影響，評估腫瘤相關巨噬細胞對不同免疫治療劑的反應。此外，將探針分子影像與MRI解剖成像相結合，也有助于識別肝臟的病理變化。總體而言，該探針在活體層面研究 NO 的生理和病理過程中的劑量依賴性具有重要作用。一氧化氮響應性磁性探針 （NRMP） 通過調節超順磁性氧化鐵納米顆粒的磁化率來實現NO的檢測（圖 1）。這些磁性探針中含有多個氧化鐵納米顆粒充當微磁體，通過偶極-偶極相互作用影響 MRI 造影劑的弛豫時間。相鄰的微磁體通過NO可切割的交聯劑相連，該交聯劑中的鄰苯二胺基團能夠與NO發生反應，隨后水解導致交聯劑發生斷裂。當探針與 NO 相互作用時，納米顆粒發生膨脹，內部微磁體之間的距離增加，偶極-偶極相互作用降低，導致納米探針的飽和磁化強度降低。最終，納米探針的T2弛豫時間延長，從而增強了 T2 MRI 信號強度。通過測量不同 NO 濃度孵育后探針的弛豫時間變化可以發現。隨著 NO 濃度的增加，NRMP 的 r2 弛豫率顯著降低，從 64.3 mM-1s-1降低至27.9 mM-1s-1。此外，選擇性測試僅在 NO 存在的情況下觀察到 T2 弛豫時間變化比的顯著增加，顯示出高特異性和抗干擾能力。重要的是，該探針能夠肝臟NO濃度的微小變化，檢測限為 0.147 μM（圖 1）。圖1 一氧化氮響應性磁性探針 （NRMP）的合成表征和性能測試NRMP作為 T2 加權成像的 MRI 探針，在與 NO 相互作用之前顯示出負對比。靜脈給藥后，NRMP 在腫瘤中積聚，增強腫瘤區域的負對比度。與瘤內 NO 的相互作用導致 NRMP 腫脹，負對比度減弱， T2信號強度增加，并產生正向對比。這種動態轉變反映了兩個不同的階段：初始探針積累和隨后探針對 NO 的響應，從而產生可切換的 MRI 信號（圖 2）。通過建立 MRI 信號和 NO 濃度之間的相關曲線來實現體內 的NO 定量。在荷瘤小鼠的瘤內注射不同濃度 NO 供體，隨后尾靜脈注射NRMP進行T2-MRI 成像。在較低劑量的 NO 供體下，腫瘤區域較暗。隨著NO供體劑量的提高，腫瘤區域亮度逐漸增加。在 NRMP 注射前和注射后 24 小時計算腫瘤的 T2-MRI 信號強度比值，顯示出劑量依賴性增加。隨后在NO 供體注射后，切除腫瘤組織，并利用傳統試劑盒測試瘤內的NO水平。通過繪制腫瘤的 T2-MRI 信號強度比與測得的 NO 濃度的關系得出的校準曲線（R2=0.957）。這種強線性相關驗證了 NRMP 準確定量腫瘤組織中 NO 濃度的能力（圖 3）。因此，NRMP 在無創和系統監測NO 相關生理過程、評估疾病進展和評估治療干預方面具有重要潛力。NO在癌癥的不同階段中具有不同的影響，例如腫瘤免疫微環境、腫瘤血管生成、腫瘤進展、侵襲和轉移。研究表明，低劑量 NO 通過直接和間接機制促進血管生成，促進腫瘤血流及營養供給和氧氣的供應。此外，低劑量NO 可以增加調節性 T 細胞 （Treg） 的比例， 從而抑制細胞毒性 T 淋巴細胞，抑制抗腫瘤免疫的能力，促進腫瘤進展。另一方面，高劑量的 NO 通過促進樹突狀細胞 （DC） 的成熟、上調細胞毒性 T 淋巴細胞、誘導腫瘤相關巨噬細胞向 M1 表型的極化，放大氧化應激來發揮抗腫瘤效果。該研究系統地研究了 NO 對腫瘤免疫微環境、腫瘤血管生成和腫瘤生長的影響，通過活體小鼠的 MRI 成像和離體腫瘤組織的免疫分析將腫瘤中的 NO 的作用與其濃度及成像信號相關聯（圖 4）。圖4 NRMP評估低劑量和高劑量NO對腫瘤進程的影響靶向腫瘤相關巨噬細胞 （TAM） 旨在將 TAM 調節成抗腫瘤 M1 表型，被認為是腫瘤免疫治療的一種有前途的策略。然而，不同的藥物在患者中會產生不同的反應效率，評估治療進展和確定療效更高的免疫治療藥物對于提高治療效果是必要的。因此，實時測量免疫反應效率對于充分了解巨噬細胞-癌細胞的相互作用以及區分對不同藥物治療的反應者和無反應者至關重要。NRMP 能夠通過量化腫瘤中 NO 成像巨噬細胞M1極化后產生的NO，從而在早期預測腫瘤治療效果，篩選用于巨噬細胞介導的免疫治療的藥物。與臨床實體瘤免疫反應評估標準相比，臨床評估標準依賴于腫瘤大小的變化進行治療評估，可能無法充分反映實體瘤中的免疫反應。免疫療法可誘導免疫細胞浸潤、水腫和出血等早期效應，導致假性進展，僅基于形態變化的評估會產生潛在的誤導性解釋。使用 NRMP 通過 MRI 對巨噬細胞產生的 NO 進行成像可在可觀察到的腫瘤大小變化之前提供早期免疫療效評估（圖 5）。NO及其衍生物在肝臟生理學和病理生理學中起著至關重要的作用。當 NO 與活性氧反應時，會形成活性氮，例如 ·NO2、ONOO-、HNO2 和 NO2+。其中，ONOO-是由 NO 和超氧陰離子反應產生的一種生物氧化劑，可以通過氧化DNA 堿基、蛋白質酪氨酸殘基和硫醇基團來誘導細胞和組織毒性，導致肝細胞死亡。因此，肝臟中 NO 含量的實時成像對于理解相關的病理過程至關重要（圖 6）。從 LPS 處理小鼠的 MRI 圖像來看，肝臟的 T2-MRI 圖像在注射后的前 30 分鐘內逐漸變暗，證實了 NRMP 在肝臟部位的逐漸積累及其最初的負對比能力。30 分鐘后，肝臟的 MRI 圖像切換到亮度，MRI 信號增加，表明在轉折點（30 分鐘）后 MRI 從 NO 觸發轉換為正對比。因此，NRMP 可以通過 MRI 檢測 NO 水平來無創評估肝損傷。考慮到 MRI 技術的解剖成像能力，NRMP還能夠將解剖成像和分子成像的優勢相結合，通過MRI信號變化識別局部肝損傷。糖尿病表現為胰島素產生不足（Ⅰ型）或胰島素敏感性降低（Ⅱ 型），這兩種糖尿病都會導致慢性高血糖癥。持續升高的血糖水平會通過多種途徑通過增加活性氧的產生來促進氧化應激。如果不加以控制，高血糖誘導的肝損傷會發展為嚴重的疾病，包括纖維化、肝硬化和肝細胞癌。在糖尿病中，NO 代謝異常是疾病發病機制及其相關并發癥的關鍵。G該研究的利用 Ⅰ型糖尿病模型來探索這些破壞對肝損傷的影響。通過施用不同劑量的鏈脲佐菌素 （STZ） 誘導小鼠糖尿病，并采用NRMP 通過 T2 加權 MRI 可視化肝損傷（圖 7）。STZ 注射后的成像結果揭示了明顯的劑量依賴性模式：單次注射導致肝臟在 70 分鐘內進行變暗，兩次注射導致初始變暗，然后亮度適度增加，三次注射導致亮度在 70分鐘觀察點明顯增加。H&E染色的組織病理分析進一步證與對照組相比，STZ 處理的小鼠肝臟的病理變化更嚴重。這些結果表明糖尿病小鼠的肝損傷程度與 MRI 信號強度比之間存在聯系，證實了 NRMP 作為揭示 NO 在糖尿病并發癥中復雜生理和病理作用的研究工具的有效性。該研究開發了一種用于體內 NO 檢測的 NRMP探針，具有高靈敏度和特異性。能夠準確監測NO的水平變化。NRMP 有助于研究NO 的復雜生理和在腫瘤中的病理作用，促進靶向治療策略的制定。除了腫瘤分析之外，NO的準確評估對肝損傷等疾病的進展預測和治療方法的選擇至關重要。此外，NRMP 為心血管疾病的研究提供了新的成像方法，為未來探究NO 在心腦血管疾病的多方面作用及劑量依賴性研究中提供了分析工具。Lu, C., Liao, S., Chen, B. et al. Responsive probes for in vivo magnetic resonance imaging of nitric oxide. Nat. Mater. (2024). https://doi.org/10.1038/s41563-024-02054-0
