多組分反應（Multicomponent reaction）是三個反應物或者更多反應物結合構筑一個產物的反應，多組分反應能夠快速合成結構復雜的化合物，但是對于酶催化劑，多組分反應仍然非常罕見。這是因為酶的催化活性位點通常無法支持多個反應物，特別是對于含有多個自由基中間體的反應。最近，人們發展了自由基分選(radical sorting)策略能夠對多個反應物參與的自由基轉化反應，但是這種反應難以控制立體選擇性。有鑒于此，南京大學黃小強教授、廈門大學王斌舉教授等報道焦磷酸硫胺素依賴酶進行定向進化，并且結合光催化劑，實現了三組分立體選擇性交叉偶聯。這個反應能夠將容易獲取的三個反應物（醛、α-溴羰基化合物、烯烴）轉化為立體結構的酮。反應機理揭示光-酶協同催化體系能夠精確形成三個自由基，構成了新型酶催化反應。這項反應表現了完美的立體選擇性，測試的33個反應中，25個反應的立體選擇性≥97%。 硫胺素依賴酶（ThDP)是自然界中非常常見的兩電子形成化學鍵和斷裂化學鍵。同時，最近人們開發的化學催化自由基分選機理拓展了自由基交叉偶聯反應，但是目前此類過程仍無法進行立體選擇性。作者基于硫胺素依賴酶（ThDP）開發了一種光/生物協同催化體系，通過簡單易得原料產生自由基。通過醛分子產生酰基自由基，α-溴羰基化合物產生親電自由基，烯烴作為自由基的受體。利用重組的三組分自由基酶直接合成含有豐富立體結構的有機酮。 以[1,1′-聯苯]-4-甲醛（1a）分子產生酰基、苯乙烯（2a）作為烯烴自由基受體、1-溴-2-丙酮（3a）產生親電自由基。使用Ru(bpy)3Cl2作為光催化劑，藍光（波長450-460nm）LED作為光源，篩選硫胺素依賴酶ThDP，發現Pseudomonas fluorescens (PfBAL)的苯甲醛裂解酶能夠催化三組分反應，但是產率僅為3%，立體選擇性為90% ee（Entry）。這種野生型PfBAL主要面臨的困難是反應生成偶姻縮合反應產物5a。酶的定向進化。通過半理性迭代定點突變策略對野生PfBAL酶進行結構進化，得到最優結構的變體3CRE-1，能夠以70%的收率和99.5%的立體選擇性生成4a，反應的苯偶姻縮合副反應選擇性得到非常好的抑制（5% 5a），（Entry 2）。分別通過位點飽和突變、分子動力學模擬輔助篩選的多輪過程得到3CRE-1變體。控制實驗驗證了ThDP輔酶、光催化劑、可見光是該反應必不可少的挑戰。通過酶的定向進化，催化反應效率顯著提高，TON達到117。 酰基自由基反應物兼容性。對一系列對位芳基/雜芳基取代基的醛，能夠實現優異的立體選擇性（≥99% ee）（4a-f）。其中對位雜芳基酮（4c-f）是非常有用的過渡金屬催化C-H鍵官能團化反應物，同時具有弱配位點和強配位點。含有富電子或者缺電子取代基的芳基醛（4g-k）兼容，對鄰位修飾氟官能團的氟苯甲醛（4l）、苯并噻吩醛（4m）有良好的兼容性。 烯烴兼容性。該反應對許多常見烯烴有著良好的反應性，能夠合成立體結構1,5-二酮化合物，對各式各樣的電子結構（4n-q）以及不同位點取代基（4q-s）兼容。這種光生物催化體系兼容許多雜環烯烴化合物，包括噻吩（4t）、呋喃（4u）、吡啶（4v）等官能團，能夠將共軛二烯烴轉化為1,7-二酮（4w）。反應兼容沒有活化的脂肪族烯烴（4x），表明該反應的廣泛應用前景。該反應兼容許多官能團。兼容的官能團包括酮（4y-aa）、酯（4ab, 4ae）、腈基（4ac）。使用市售二氟甲基化試劑3g，能夠生成立體結構富集的二氟酮（4ad），反應兼容重氮化合物（4ae）。消旋的α-鹵酮能夠生成不同立體比例的二酮（4af, 4ag）。反應可進行放大量合成，以63%的產率生成4a，以61%的產率生成4b，以36%的產率生成4ab，且放大量沒有影響產物立體選擇性。該反應具有優異的立體選擇性控制，溫和反應條件，對許多官能團容忍，這種新型生物催化反應顯著拓展了分子的復雜性。提出了光催化-酶催化協同催化反應。首先硫胺素依賴酶（ThDP）的3CRE變體和1醛分子反應生成Breslow中間體（Int. A）。隨后被[Ru]*光催化劑單電子氧化-脫氫生成酰基自由基Int. B，同時還原的[Ru]·-將自由基前體3進行單電子還原，生成親電自由基Int. C。隨后Int. C對烯烴分子2自由基加成，生成前手性親核性自由基Int. D，最后在酶催化活性位點發生化學選擇性和立體選擇性自由基交叉偶聯反應，生成立體結構的有機酮。通過實驗和理論計算驗證機理。通過Stern-Volmer還原淬滅反應，說明在只有醛（1a）和酶的體系，發生還原淬滅[Ru]*。計算Breslow中間體（Int. A）對[Ru]*的電子轉移，發現電子轉移放熱46.4kcal mol-1，在熱力學上容易發生。相比的氧化淬滅反應為吸熱過程（吸熱21.8kcal mol-1），因此確立光催化反應的還原淬滅過程。 通過分子對接和分子動力學模擬，驗證[Ru]能夠通過π-π相互作用，結合在酶催化活性位點的F283基團附近。因此[Ru]和Int. A之間距離靠近，能夠高效率的轉移電子和中間體，促進三組分自由基反應的高效率。高效率的淬滅反應同樣驗證這個結論。分子動力學模擬結果表明H113基團作為堿，對Int. A脫質子生成自由基陽離子（Int. A·+），促進轉化為Int. B。通過量子力學/分子動力學（QM/MM）計算驗證Int. A·+容易對H113基團轉移質子（能壘僅為2.1kcal mol-1，反應放熱4.5kcal mol-1）。驗證[Ru]·-進行單電子還原能夠產生Int. C。該反應為放熱過程（3.9kcal mol-1），通過室溫DMPO捕獲實驗進行ESR測試，驗證生成DMPO/Int. C加合物。在靠近酶催化口袋或者酶催化口袋內部生成Int. B和Int. C。通過控制實驗驗證，生成C(sp2)-C(sp3)的關鍵步驟在酶活性活性位點進行，因此能夠得以保證酶催化劑能夠控制反應產物的立體選擇性。Xing, Z., Liu, F., Feng, J. et al. Synergistic photobiocatalysis for enantioselective triple radical sorting. Nature (2024) DOI: 10.1038/s41586-024-08399-5https://www.nature.com/articles/s41586-024-08399-5
