血液是由多種蛋白質和細胞組成的復雜組織，在廣泛調節機制的作用下以達到抗凝和凝血之間的動態平衡，從而保證體內的生理流動。當人工界面暴露于血液中時，凝血的接觸途徑被激活，最初是通過酶原因子 XII （FXII） 裂解為活性形式觸發的。由于 FXII 中表面誘導的構象變化被認為是啟動凝血激活的第一個事件，抑制 FXII 表面相互作用是實現抗血栓形成表面最直觀的方法。然而，這種策略依賴于一個未經證實的前提，即防污表面不會激活從表面解吸的凝血蛋白。此外，脫落的凝塊或在遠離防污表面的部位形成凝塊會導致更嚴重的后果。目前還沒有完全防止凝血接觸激活的抗血栓形成表面的報道。因此，抗凝劑通常與人工裝置或植入物聯合使用，以防止裝置/植入物相關的血栓形成，這本身會增加出血風險。盡管存在各種不確定性，但抗血栓形成表面的主要且可能唯一的設計方法是基于抑制蛋白質-表面相互作用。近日，哥倫比亞大學血液研究和生命科學研究所中心的 Jayachandran N. Kizhakkedathu副教授與四川大學高分子科學與工程學院趙偉鋒副研究員，通過優化與凝血因子 XII 的相互作用開發了一種具有屏蔽正電荷的抗血栓聚合物涂層。涂層的抗血栓特性在體外用人血液和體內使用兔頸動脈-頸靜脈分流模型得到證明。該涂層與因子 XII 表現出很強的相互作用，降低了接觸途徑介導的凝塊形成。這些發現與通過蛋白質排斥表面接觸的抗血栓材料設計策略相矛盾。該聚合物涂層可以使大多數血液接觸設備受益。檢查具有不同表面特性的表面在血漿中凝血激活的影響，與單獨使用血漿相比，它們縮短了血漿凝固時間。然而，唯一例外是帶正電的表面，它對血漿凝固的影響很小。這提出了一種使用陽離子表面開發抗血栓形成表面的新方法的可能性。然而，傳統的陽離子表面在血液中激活血細胞，引發免疫反應并產生細胞毒性。在作者團隊之前的研究中，他們開發了一個生物相容性與帶正電荷的大分子 （SPCM） 庫。與裸露的帶正電荷的大分子相比，這些 SPCM 與目標生物分子保持了很強的相互作用，同時表現出良好的血液相容性。設計一種基于表面共軛 SPCM 的通用基材獨立涂層，稱為選擇性蛋白質相互作用 （SPI） 涂層，以實現對蛋白質相互作用和選擇性蛋白質結合與隱藏的正電荷的控制。該 SPCM 由一個超支化聚甘油（HPG）核心組成，核心上裝飾著~11個甲基化三（2-氨基乙胺）（R）基團，并由甲氧基-PEG（mPEG350）鏈的殼層保護。該分子在PEG鏈末端被大約四種伯胺官能化，用于表面共軛。使用了由 PDA/PEG 與 SPCM 共價偶聯的基于聚多巴胺 （PDA） 的涂層，因為這允許其應用于不同的生物醫學設備或表面，而無需預處理。通過將涂層暴露在惡劣的條件下，沒有厚度變化。光譜特征證實了 SPI 涂層的穩定性。SPI 涂層的水接觸角 （~10°） 證實了涂層的高度親水性。表面 zeta 電位測量值表明 SPI 涂層具有輕微的負電荷 （?7 mV），這與 SPCM 或 PDA/PEG 涂層不同。
由于大多數表面通過接觸途徑激活凝血，研究 SPI 涂層對人血漿中血液凝固接觸途徑激活的影響。在血漿中孵育 SPI 包被表面和對照表面后，顯色底物 S-2302 對 FXIIa 和激肽釋放酶的切割效率被用作接觸激活的量度。與未涂層表面相比，SPI 涂層孵育的接觸活化顯著減少，而其他親水性對照涂層如 PDA/PEG 和 HPG/PEG 涂層保持表面誘導的接觸活化。使用玻璃作為陽性對照，這是一種有效的接觸通路激活劑。與其他涂層相比，SPI 涂層顯著抑制了緩激肽 （BK） 的生成。SPI 涂層還顯著抑制了凝血酶以及凝血酶-抗凝血酶 （TAT） 復合物的形成。此外，與其他涂層基材相比，SPI 涂層顯著延長了血漿凝固時間。這些數據提供了 SPI 涂層抗血栓形成特性的初步證據。使用涂層玻璃在再鈣化血漿中進行額外的凝血研究。未改性的玻璃表面在 10 分鐘內誘導凝塊形成，而 SPI 涂層將凝血時間延長至 1 小時以上。在血漿與 SPI 涂層初始孵育 30 分鐘后，通過引入肌動蛋白觸發凝血。結果表明，在與 SPI 涂層一起孵育的血漿中，凝血沒有受到抑制或延遲。此外，即使在長期儲存后，SPI 涂層的抗血栓功能仍然很強大，即使在吸附其他血漿蛋白后，其有效性也沒有顯著降低。
圖 SPI 涂層可防止表面誘導的接觸激活和血栓形成傳統的抗凝材料/療法可能會因正常止血中斷而復雜化，存在出血風險。預計 SPI 涂層不會干擾正常凝血，它旨在減少表面誘導的接觸激活。與 SPI 涂層孵育 30 分鐘后，血漿中的凝血酶原時間 （PT） 、活化部分凝血活酶時間 （aPTT） 、凝血酶時間 （TT） 和纖維蛋白原濃度與正常值相比沒有變化。SPI 涂層也不會激活凝血因子 VII （FVII），從而阻止凝血和纖溶系統的下游激活。蛋白質組學研究確認與 SPI 涂層一起孵育的血漿中不同凝血蛋白的濃度與正常濃度相比沒有明顯變化，特別是對于參與接觸激活的那些蛋白質。激活的 FXII 可以觸發下游的凝血激活。為了探討在沒有抗凝劑的情況下 SPI 涂層對凝血系統的潛在影響，將再鈣化血漿與 SPI 涂層玻璃一起孵育，并通過重新添加檸檬酸鈉。當血漿與玻璃表面一起孵育時，PT、aPTT 和 TT 值顯著延長，因為凝血因子，尤其是纖維蛋白原的耗竭。相比之下，SPI 涂層不會影響 PT 或 TT 值，而 aPTT 值略微延長。活化的凝血因子被其他抑制蛋白迅速中和，導致內源性凝血因子耗竭，進而導致 aPTT 的輕微延長。進一步分析顯示，玻璃表面共孵育血漿中凝血因子 IX （FIX） 、凝血因子 XI （FXI） 和 FXII 的活性顯著升高，而凝血因子 VIII （FVIII） 耗盡。然而，在 SPI 涂層孵育的血漿中，FIX、FXI 和 FXII 的活性僅略有減弱。SPI 涂層還可以抵抗血小板和中性粒細胞的粘附和活化，并顯示出良好的細胞兼容性和低補體激活。
SPI 涂層在動靜脈分流模型中具有抗血栓形成作用：使用兔動靜脈 （AV） 分流模型研究了 SPI 涂層的抗血栓形成功能，以評估無抗凝劑給藥的導管內血栓形成。血流通過連接到聚氯乙烯 （PVC） 導管的留置針從頸動脈流向頸靜脈，該導管要么經過 SPI 涂層改性，要么未經改性。30 分鐘后，未涂層的導管誘導了嚴重的導管內血栓形成， 并且通過導管的血流幾乎停止。然而，SPI 涂層導管顯著減少了表面誘導的血栓形成。與實驗開始時的流速相比，在 30 分鐘時通過 SPI 涂層導管的血流速沒有觀察到顯著差異。此外，與實驗開始時采集的血液相比，手術后從裸露導管采集的血液的凝固時間顯著縮短。手術前后從 SPI 涂層導管采集的血液在凝血時間上沒有顯著差異。此外，血栓對 SPI 涂層導管的依從性顯著降低。然而，還是觀察到一些凝塊沉積在通過窄針連接到動脈的 SPI 涂層導管上，歸因于局部血流動力學的劇烈變化。由于 SPI 涂層不具有固有的抗凝特性，因此無法防止由非自身誘導因子引起的凝血激活。
圖 SPI 涂層在 AV 分流模型中具有抗血栓形成作用SPI 涂層與 FXII 強相互作用而誘導其激活：盡管 SPI 涂層顯著減少了接觸活化和血栓形成，但尚不清楚 SPI 涂層如何產生這種活性。分析了血漿 SPI 涂層上吸附的蛋白質電暈，以了解生物界面吸附蛋白的作用及其抗血栓形成功能。設計不同的洗滌步驟，通過蛋白質組學分析分別在玻璃和 SPI 涂層表面上研究松散和緊密結合的蛋白質的組成。輕輕洗滌后，松散結合的蛋白質大部分保留在兩個表面上。盡管蛋白質的數量相似，但裸玻璃和 SPI 涂層表面顯示出不同的組成。與 SPI 涂層相比，玻璃表面吸附了更多的凝血蛋白和更少的免疫球蛋白。專注于接觸激活系統中的蛋白質，發現 SPI 涂層表面比玻璃表面吸附更多的 FXII。SPI 涂層表面的 FXI、前激肽釋放酶和激肽原的量低于玻璃表面的量。徹底清洗區分松散結合和緊密結合的蛋白質的組成。玻璃表面比 SPI 涂層吸附更多的免疫球蛋白和凝血蛋白。然而，SPI 涂層表面比玻璃表面具有更多的吸附FXII。數據表明，與玻璃表面相比，SPI 涂層表面與FXII 相互作用強烈。結果表明，FXII 與表面的強烈相互作用可能不是啟動表面誘導凝血激活的充分條件。
表面和 FXII 之間的強烈相互作用可能不是其激活和開始凝血接觸途徑的先決條件。分析包括 SPI 涂層（低血栓形成性）、HPG/PEG 涂層（中性防污表面，中度血栓形成性）和玻璃（高度血栓形成性），以探究 SPI 涂層抑制表面誘導血栓形成的機制。將 FXII-PK 混合物與不同表面孵育后，對底物 S-2302 的切割進行定量。玻璃和 HPG/PEG 涂層的催化活性分別比 SPI 涂層至少高 30 倍和 4 倍。不同表面的 S-2302 切割程度與它們形成血栓形成的傾向相對應。在 C1INH 存在下，與 HPG/PEG 涂層一起孵育的 FXII-PK 混合物的催化活性可以忽略不計。可以觀察到這些材料表面不會誘導溶液中 FXII 和 PK 的水解。然而，與玻璃表面孵育的 FXII 可以顯著增強與 PK 的相互激活，即使在表面從溶液中去除后也是如此。與玻璃表面不同，在 SPI 涂層的情況下沒有看到這種活動。此外，在不同表面孵育后，未觀察到 FXIIa、PK 和 KK 的活性發生顯著變化。研究表面解離的 FXII 是否發生構象變化，應用改進的靶向蛋白質組學方法和二甲基標記技術。研究表明，賴氨酸對表面解離的 FXII 的標記效率與其天然狀態顯著不同。然而，與其他表面不同，SPI 涂層的這些結構變化并沒有導致 FXII 活性的增強。對于傳統的合成表面，FXII 可以發生某些構象變化，無論蛋白質是從表面吸附還是解吸，這些變化都可以啟動和增強接觸激活。然而，在 SPI 涂層的情況下，即使表面誘導的 FXII 構象變化是不可避免的，也不會發生接觸激活啟動，這導致 FXIIa 的產生缺乏，材料表面誘導的血栓形成顯著減少和正常止血功能的保留。
作者團隊展示了通用抗血栓表面設計中的一個新概念，它通過改變 FXII 與表面的結合減少了表面誘導的血栓形成，同時不會干擾正常的止血。SPI 涂層具有遮蔽的帶正電的表面，可以防止 FXII-PK 的相互激活。與生成利用蛋白質抗性或防污表面的血液接觸表面的傳統觀點不同，本文提出了一個新的方向——通過產生一種蛋白質結合 SPI 涂層，該涂層與 FXII 積極相互作用，但使其在啟動凝血接觸途徑方面失活。除了為血液接觸裝置產生通用的抗血栓形成表面外，這項工作還顯著增強了對接觸途徑中蛋白質與表面相互作用的理解。這反過來又為具有改進的血液相容性的下一代血液接觸表面提供了新的設計策略。具體而言，（1） FXII-PK 的相互激活在生理條件下已經發生，防污表面可能會增加這種激活。在生理條件下維持受表面相互作用影響的 FXII-PK 復合物的活性對于產生抗血栓形成表面更為重要。（2） 根據蛋白質組學分析，凝血蛋白，尤其是 FXII，幾乎被吸附到所有表面上。然而，表面-FXII 相互作用/結合可能不是 FXII 激活的先決條件，并且所有這些表面相互作用可能不會增加 FXII-PK 的相互激活。（3） 表面誘導的凝血激活可能不僅限于生物界面。從表面釋放的蛋白質可以激活遠離表面的凝血。因此，當前用于開發基于防污表面的抗血栓形成表面的策略需要認真重新考慮。但本研究仍有許多問題需要解決。SPI 涂層比傳統的防污表面吸引更多的血液蛋白質。因此，需要回答的一個關鍵問題是 FXII 的單層還是多層吸附在 SPI 涂層-FXII 相互作用中占主導地位。此外，了解其他血漿蛋白的吸附是否對 SPI 涂層-FXII 相互作用有顯著影響也很重要。SPI 涂層的特性與 FXII 的特定結合域之間是否存在任何相關性？它與 SPI 涂層中構象改變的 FXII 的解吸行為有何關系？不同的 FXII 表面結合位點如何影響其構象變化，FXII 的哪些構象容易誘導凝血激活或抑制，血漿中構象改變的 FXII 的穩定性如何？這些基本問題需要在未來得到解答，并可能對 SPI 涂層的作用機制及其作為抗血栓形成表面的功能提供更深入的理解。Haifeng Ji, Kai Yu, Srinivas Abbina, et al. Antithrombotic coating with sheltered positive charges prevents contact activation by controlling factor XII-biointerface binding. Nat Mater. 2024 Nov 12.https://www.nature.com/articles/s41563-024-02046-0
